干货分享｜原代大鼠三叉神经节神经元（TGN）分离培养完整实操 Protocol

三叉神经节神经元（TGN）是研究头面部痛觉、偏头痛、神经病理性疼痛、三叉神经损伤修复的经典体外细胞模型，原代分离培养直接决定后续造模、药物筛选、免疫荧光、电生理等实验成败。 很多新手做 TGN 原代细胞时容易遇到杂细胞过多、神经元存活率低、消化过度碎细胞、贴壁差、提前凋亡等问题，反复踩坑浪费乳鼠与试剂。今天整理一套本人多次验证、重复性稳定的 SD 乳鼠三叉神经节原代分离完整实操方案，从前期包被、解剖取材、消化离心到培养鉴定全流程细化，附带关键避坑要点，新手也能一次做出高纯度活性良好的三叉神经元，适合疼痛、神经生物学方向科研人直接收藏复用。

一、实验材料

1. 实验动物

出生 1–3 日龄 SD 乳大鼠，雌雄不限，单次实验推荐 5 只，幼鼠神经元活力强、胶质杂细胞占比低。

2. 组织样本

大鼠三叉神经节（TG）

3. 手术器械

手术剪、粗解剖镊、精细眼科剪、眼科镊（提前高压灭菌备用）

4. 消化试剂

Ⅱ 型胶原酶

5. 神经元完全培养基

Neurobasal-A 基础培养基 + B-27 添加剂 (50×) + 1% 青链霉素双抗

6. 培养板包被液

0.1 mg/mL 多聚赖氨酸溶液

二、标准化实验操作步骤

1. 培养板提前包被（关键：保证神经元贴壁）

取 0.1 mg/mL 多聚赖氨酸加入 6 孔板，液面完全覆盖板底即可； 两种包被方案任选：37℃孵箱放置 2 h，或 4℃冰箱过夜； 使用前无菌 PBS 洗涤孔板 3 次，超净台内自然晾干备用。

2. 乳鼠消毒处死

将新生乳鼠完全浸泡 75% 医用酒精 5 min，充分体表灭菌，降低取材污染风险。

3. 解剖取材三叉神经节（全程冰上操作）

1. 沿枕骨大孔剪开皮肤、逐层剥离颅骨与颞骨，剔除大脑、小脑组织，充分暴露颅底三叉神经节；
2. 完整剥离 TG 组织，立即放入预冷、含 2% 双抗的无菌 PBS；
3. 预冷 PBS 反复冲洗组织 3 次，去除血液、组织碎屑。

4. 组织剪碎与酶消化

眼科剪将神经节剪碎至 1–2 mm³ 细小组织块，加入适量 0.1% Ⅱ 型胶原酶； 37℃恒温消化 30 min，每间隔 10 min 轻柔吹打一次，加速组织解离； 肉眼无明显块状组织即可终止消化。

5. 离心收集细胞（无需过滤，简化操作减少细胞损耗）

消化混合液直接转移离心管，1200 rpm 离心 5 min； 缓慢弃去上清，避免吸走细胞沉淀。

6. 细胞铺板培养

加入配制好的神经元专用完全培养基轻柔重悬细胞沉淀，均匀接种至提前包被完成的培养板 / 培养瓶。

7. 换液与细胞生长周期

铺板后第 3 天进行首次换液，此时细胞密度可达 60%–80%，神经元形态完整、突起舒展； 持续培养至 10 天左右，神经元会逐步出现老化、凋亡，不建议长期传代培养。

三、核心避坑备注（实操高分要点）

1. 乳鼠日龄严格把控：优先选用刚出生 1–3 天新生乳鼠，日龄越大神经元活力下降、胶质杂细胞大量增殖，纯度大打折扣；
2. 全程低温保护细胞：取材、漂洗、剪碎组织全程冰上操作，减少离体神经元缺氧损伤；
3. 省略过滤步骤：消化后无需细胞筛过滤，直接离心，过滤会大量损失神经元，大幅降低细胞得率；
4. 控制实验周期：铺板 3 天细胞状态最佳，适合给药、造模、免疫荧光检测；培养超过 10 天神经元凋亡明显，杂细胞过度增殖干扰实验结果。

四、细胞形态与特异性鉴定说明

1. 白光镜下细胞形态

图1：铺板 3 d 100 倍镜：神经元贴壁稳定，胞体透亮，长出细长神经突起；

:图二：铺板 3 d 200 倍镜：可清晰区分神经元胞体、突起网络，细胞轮廓清晰。

2. 免疫荧光特异性鉴定（神经元纯度验证）

采用两种经典神经元标志物染色鉴定，排除胶质细胞污染：

1. NeuN（成熟神经元核标记）：200 倍、400 倍荧光镜下可见神经元细胞核特异性荧光；

2.β-Tubulin III（神经元骨架蛋白）：200 倍、400 倍镜下胞体及神经突起均呈阳性荧光信号。

两种标志物双阳性可证明分离细胞为高纯度三叉神经节神经元。

这套 TGN 原代分离方案经过多次实验优化，省去过滤步骤减少细胞损耗，搭配多聚赖氨酸过夜包被大幅提升贴壁率，完美解决新手常见的细胞存活率低、纯度差、污染三大难题。 整体操作门槛适中，试剂与耗材均为神经实验室常规配置，取材后 3 天即可获得状态优良的成熟三叉神经元，适配疼痛机制、神经炎症、离子通道、药物镇痛筛选等各类体外功能实验。