【实验技术笔记】利用重组载体做基因过表达（pCDH载体）

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已于 2022-06-20 01:02:29 修改 · 2.8w 阅读

于 2022-06-19 16:27:38 首次发布

本文详细介绍了如何利用重组载体进行基因过表达操作，包括设计 PCR 引物、PCR 扩增、酶切载体、电泳回收、连接、转化和阳性克隆挑选等步骤。此外，还提及了基因过表达在探究细胞表型变化中的作用，以及转染方法和检测过表达效果的技巧。

为什么要做基因表达操作？

探寻影响细胞表型变化（增殖、凋亡、焦亡等）相关的分子，了解这些分子之间相互作用的关系（机制）
分子-机制-表型的关系
对谁操作？
① DNA，如 CRISPR-Cas9 对细胞本身的 DNA 删除、添加或替换；最常见的操作如过表达，将外源 DNA 导入细胞，利用细胞的转录翻译系统表达相应的蛋白质。
② 利用具有干扰作用的小 RNA，降解细胞内源 RNA 或抑制翻译，从而影响蛋白质的表达量。

基因过表达操作流程

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1. 构建基因过表达载体

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（1）寻找 CDS 序列

（2）分析酶切位点：找出载体多克隆位点 MCS 有，而插入基因中无的酶切位点。

DNAMAN 中载入 TNF 序列文件：Sequence → Load Sequence → From Sequence File → 选择前面保存的 TNF.seq 序列文件。
寻找 TNF 基因中的酶切位点：Restriction → Restriction Analysis → 勾选 Show summary 和 Show sites on sequence → 下一步→Select All → 完成。
关注输出结果中的 Non Cut Enzymes （不会切 TNF 基因的酶切位点），找出载体（以pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP载体为例）多克隆位点 MCS 有，而插入基因中无的酶切位点。
找出切割效率高的酶切位点：切割效率达到 90%以上最好；排除同尾酶，即切割后的粘性末端不能一样（如 XbaⅠ和 NheⅠ是同尾酶）。