【和訳】ナトリウム-カリウムATPアーゼの拮抗作用がチクングニアウイルス感染を阻害する

2024年8月24日 21:36

DeepLを用いて和訳しました。機械翻訳ですので原著を参照ください。

原著

【和訳】ナトリウム-カリウムATPアーゼの拮抗作用がチクングニアウイルス感染を阻害する
Alison W. Ashbrook, et. al.
mBio. 2016 May-Jun; 7(3): e00693-16. Published online 2016 May 24

要旨
チクングニアウイルス（CHIKV）は、発熱、関節痛、発疹の流行を世界中で引き起こしている再興アルファウイルスである。現在、CHIKV疾患の予防や治療に使用できるワクチンや抗ウイルス療法は認可されていない。我々は、ハイスループットの化合物スクリーニングを行い、ナトリウム-カリウムATPアーゼを阻害する心臓配糖体であるジゴキシンが、CHIKV感染の強力な阻害剤として同定された。ジゴキシンまたは関連する心臓配糖体であるウアバインでヒト細胞を処理すると、CHIKVによる感染が用量依存的に減少した。ジゴキシンによる阻害は細胞型に特異的であり、マウス細胞または蚊細胞をジゴキシンで処理してもCHIKV感染は減少しなかった。ジゴキシンは、ロスリバーウイルスやシンドビスウイルス、哺乳類のレオウイルスや水疱性口内炎ウイルスなど、他のアルファウイルスに対しても抗ウイルス活性を示した。ジゴキシンによるCHIKVおよびレオウイルス感染の阻止は、1つまたはそれ以上の侵入後のステップで起こった。ジゴキシン耐性CHIKV変異体の選択により、複製複合体の形成とウイルスRNAの合成に必要な非構造タンパク質に複数の変異が確認された。これらのデータは、CHIKV複製のポストエントリー段階を促進するナトリウム-カリウムATPアーゼの役割を示唆し、広範な抗ウイルス戦略としてこの経路を調節する根拠となる。

重要性
世界的に蔓延している蚊媒介性関節炎原性アルファウイルスによって引き起こされる疾患の軽減には、新しい抗ウイルス戦略の開発が必要である。臨床的に試験された化合物のハイスループットスクリーニングは、十分に特性化された治療薬の未発見の抗ウイルス機能を同定し、ウイルス感染に必要な宿主経路を明らかにする迅速な手段を提供する。本研究では、心臓配糖体ジゴキシンによるCHIKVおよび関連アルファウイルスの強力な阻害について述べ、CHIKV感染におけるナトリウム-カリウムATPアーゼの機能を実証した。

チクングニアウイルス（CHIKV）は、世界中で爆発的な流行を引き起こす関節炎原性アルファウイルスである。2004年にケニアで再流行して以来、サハラ以南のアフリカやアジアに加え、ヨーロッパやアメリカなど、以前はCHIKVが流行していなかった地域でも、数百万件のCHIKV症例が報告されている(1-6)。カリブ海流域や南米の多くの国では、CHIKVの自生的な蚊による伝播が続いており、これらの地域にはCHIKVを媒介する蚊が生息していることから、新たな集団にCHIKVがさらに広がる可能性がある。
CHIKV感染者の大多数は、衰弱性の多発性関節痛、関節炎、頭痛、発疹を特徴とする疾患であるチクングニア熱を発症する(7, 8)。最近の流行では、新生児、高齢者、基礎疾患を持つ人などで報告されている神経症状や心臓症状など、より重篤な障害や非典型的な症状も観察されている（9-11）。臨床症状のほとんどはほとんどの臨床症状や徴候は感染後7～10日で消失するが、関節炎や多発性関節痛は最初の診断から数ヵ月～数年後に再発することがある(2, 8, 12)。現在までのところ、認可された抗CHIKV治療薬やワクチンはない。この慢性的で無力な疾患は、素朴な集団におけるウイルスの高い攻撃率に加えて、感染者の生活の質および感染国の経済に大きな負担を強いている(13-15)。
CHIKVはヒトにおいて広範なトロピズムを示すが、感染に必要な宿主因子の多くは完全には解明されていない。未同定の細胞表面レセプターを介して宿主細胞に付着した後、CHIKV粒子はクラスリンを介したエンドサイトーシスによって内在化される(16-18)。エンドソームの酸性化は、ウイルスエンベロープと宿主エンドソーム膜の融合を引き起こし、ヌクレオカプシドの細胞質への放出を可能にする（19, 20）。CHIKVゲノムは長さ約12kbの一本鎖のポジティブセンスRNA分子からなり、4つの非構造タンパク質（nsP1～4）と3つの主要構造タンパク質(カプシド、pE2、E1）をコードしている(21, 22)。非構造プロテインは共に、細胞膜や他の宿主因子との相互作用を媒介し、サブゲノムRNAの合成と、子孫ビリオンにカプセル化するためのウイルスゲノムRNAの追加コピーを収容する複製複合体を形成する(23-28)。アルファウイルス、特にCHIKVのウイルスRNA合成に関与する宿主因子とそのメカニズムは、まだ十分に解明されていない。
CHIKV複製の宿主メディエーターを同定するために、我々は、増強型緑色蛍光プロテイン（eGFP）レポーターを発現するCHIKVレプリコン粒子によるヒト骨肉腫（U-2 OS）細胞の感染を増強または減少させる能力について、小分子のライブラリーをスクリーニングした。このスクリーニングから、ナトリウム-カリウムATPアーゼに拮抗する心臓配糖体であるジゴキシンが、CHIKV感染の強力な阻害剤として同定された。ジゴキシンは、U-2 OS細胞と初代ヒト滑膜線維芽細胞の両方において、複製コンピテントCHIKVによる感染を減少させた。関連する配糖体であるウアバインもCHIKV感染を阻害した。カリウムの細胞外濃度を高めると、ジゴキシンによるCHIKV阻害が緩和されたことから、ナトリウム-カリウムATPアーゼの拮抗作用が抗ウイルス効果を媒介することが示唆された。ジゴキシンは、ロスリバーウイルス（RRV）やシンドビスウイルス（SINV）を含むCHIKV以外のアルファウイルスや、無関係な哺乳類のオルソレオウイルス（ここでは「レオウイルス」と呼ぶ）や水疱性口内炎ウイルス（VSV）に対しても抗ウイルス活性を示した。ジゴキシン処理した細胞でCHIKVを継代すると、非構造タンパク質をコードする遺伝子に変異が選択され、ジゴキシンがこれらのレプリカーゼタンパク質を介する機能を障害していることが示唆された。これらのデータは、CHIKV感染におけるナトリウム-カリウムAT-Paseの役割を示唆し、CHIKVの複製と疾病を制限する治療薬の開発に向けた新たな戦略を浮き彫りにした。

結果
CHIKV感染阻害剤としてのジゴキシンの同定。CHIKV感染に必要な宿主因子を同定するため、NIH Clinical Collection（NCC）から、CHIKVレプリコン粒子による感染を阻害または増強する能力を持つ727種の化合物をスクリーニングした（図1A）。NCCライブラリーは、第1相、第2相、第3相臨床試験で使用された化合物でほぼ構成されている。U-2 OS細胞を、ビヒクルコントロールとしてジメチルスルホキシド（DMSO）、陽性コントロールとして100 nMのバフィロマイシンA1、または1 MのNCC化合物と1時間インキュベートし、処理した細胞にeGFPを発現するCHIKV SL15649株レプリコン粒子を吸着させ、20～24時間インキュベートした。7種類の化合物の平均Zスコアは 2.0（感染抑制）、21種類の化合物の平均Zスコアは 2.0（感染促進）であった（図1B）。CHIKV感染にプラスにもマイナスにも影響した化合物で最も多かったのは、ステロイドやホルモンのシグナル伝達および生合成経路に影響する化合物であった（図1C）。CHIKV感染はまた、ドーパミンやセロトニンのようなイオントランスポーターや神経伝達物質受容体を標的とする化合物によっても、プラスとマイナスの両方の影響を受けた。翻訳阻害剤であり、CHIKV感染に対するアンタゴニストとして知られるホモハリントニン（29）は、負のZスコアが最も大きく、41.94であった。ナトリウム-カリウムATPアーゼ阻害剤であるジゴキシンの負のZスコアは 26.67で、CHIKV感染におけるナトリウム-カリウムATPアーゼの機能を示唆している。

図1 CHIKV感染阻害剤を同定するためのハイスループットスクリーニング。(A) U-2 OS細胞を、DMSO、100 nMのバフィロマイシンA1、またはNIHクリニカルコレクションの化合物（濃度1 µM）と37℃で1時間インキュベートした。細胞をSL15649 eGFPレプリコン粒子とMOI～5 IU/cellで吸着させ、化合物と37℃で20～24時間インキュベートした。(B）個々の化合物についてロバストZスコアを計算した。3回の独立したスクリーニング実験で同定された各プレートの中央値からの絶対値偏差が≦2または≧2のロバストZスコアを持つ化合物の平均ロバストZスコアを示す。(C）既知の生物学的標的による候補化合物の分布。

ジゴキシンはCHIKV感染の種特異的阻害剤である。

ナトリウム-カリウムATPアーゼの阻害が複製コンピテントCHIKVによる感染を阻害するかどうかを調べるため、以下の実験を行った。様々な細胞株を、CHIKV吸着前にDMSO、陽性対照として5-ノニルオキシトリプタミン（5-NT［セロトニン受容体作動薬］）（30）、または高濃度のジゴキシンで1時間処理した。感染後6時間で、間接免疫蛍光法により感染の有無を調べた（図2）。DMSO処理細胞と比較して、U-2 OS細胞をジゴキシンで処理した場合、CHIKV感染は用量依存的に減少し、最大有効濃度（EC50）は48.8 nMであった（図2A）。ジゴキシン処理によって、主要なヒト滑膜線維芽細胞（HSF）およびVeroアフリカミドリザル腎細胞のCHIKV感染も同様に減少し、EC50はそれぞれ43.9 nMおよび67.3 nMであった（図2Bおよびデータは示さず）。細胞への吸着前にウイルスをジゴキシンとインキュベートしても、ウイルス力価には影響がなかったことから、抗ウイルス効果はウイルスの変化によるものではないことが示唆された（データは示さず）。複数の霊長類細胞型におけるCHIKV感染の阻害にもかかわらず、霊長類細胞への感染を阻止するのに十分な量のジゴキシンをmu-rine stromal ST2およびAedes albopictus C6/36細胞に処理しても、CHIKV感染は減少しなかった（図2CおよびD）。これらのデータを総合すると、ジゴキシンはCHIKV感染の強力な阻害剤であり、阻害は宿主の種特異的な方法で起こることが示された。

図2 ジゴキシンはヒト細胞のCHIKV感染を強力に阻害する。(A) U-2 OS細胞、(B) HSF、(C) ST2細胞、または(D) C6/36細胞を、5 PFU/細胞のMOIでCHIKV SL15649株を吸着させる前に、DMSO、10 µM 5-NT、または濃度の増加したジゴキシンと1時間インキュベートした。1時間のインキュベーション後、ウイルスを除去し、細胞をDMSOまたは阻害剤を含む培地で5時間インキュベートした。細胞をCHIKV特異的抗血清とDAPIで染色して核を検出し、蛍光顕微鏡で画像化した。結果は、3連実験のDMSO処理細胞に対して正規化した感染細胞のパーセンテージで示した。エラーバーは平均値の標準誤差を示す。ANOVAとTukeyのpost hoc testの結果、*, P < 0.05, **, P < 0.01, ***, P < 0.001。

ジゴキシンによる種特異的阻害は、ナトリウム-カリウムATPアーゼを介して起こる。心配糖体は、触媒サブユニットに結合することによってナトリウム-カリウムATPアーゼを阻害するが、ヒトに比べ、特定のマウスアイソフォームに対する阻害効率は低い(31-33)。高用量のジゴキシンがマウス細胞のCHIKV感染を阻害できるかどうかを調べるため、ST2細胞および筋芽細胞C2C12細胞を、CHIKV吸着前にDMSO、5-NT、または高濃度のジゴキシンで1時間処理した。感染後6時間で、間接免疫蛍光法により感染の有無を調べた（図3AおよびB）。高濃度では、ジゴキシン処理は、これらの細胞型におけるCHIKV感染を有意に減少させた。EC50は、ST2細胞で16.2 M、C2C12細胞で23.2 Mであり、U-2 OS細胞におけるジゴキシンのEC50の330倍および475倍の値であったが、細胞生存率は減少しなかった（データは示さず）。これらのデータは、ジゴキシンがマウス細胞のCHIKV感染を阻害できるが、ヒト細胞よりも有意に高濃度であることを示している。

図3 マウス細胞におけるジゴキシンに対するCHIKV耐性は、ナトリウム-カリウムATPアーゼのα3サブユニットの発現低下と相関する。(A）ST2細胞または（B）C2C12細胞を、5 PFU/細胞のMOIでCHIKV株SL15649を吸着させる前に、DMSO、10 µM 5-NT、または高濃度のジゴキシンと1時間インキュベートした。1時間後、ウイルスを除去し、細胞をDMSOまたは阻害剤を含む培地で5時間インキュベートした。細胞をCHIKV特異的抗血清とDAPIで染色して核を検出し、蛍光顕微鏡で画像化した。結果は、3連実験のDMSO処理細胞に対して正規化した感染細胞のパーセンテージで示した。エラーバーは平均値の標準誤差を示す。(C）U-2 OS細胞およびST2細胞を、5 PFU/細胞のMOIでCHIKV 181/25に模擬感染または感染させた。RNAを単離し、ヒトまたはマウス特異的プライマーセットを用いたATP1A1（α1）、ATP1A3（α3）、およびGAPDH転写物のRT-PCR増幅に使用した（補足資料の表S1を参照）。反応産物は1％アガロースゲルで電気泳動して分離した（左）。バンド強度は4つの独立した実験について光学デンシトメトリーで定量した（右）。***ANOVAとTukeyのpost hoc testによりDMSOと比較してP < 0.001を示した。

次に、試験したヒトおよびマウス細胞における2つのサブユニットアイソフォーム（1および3）の転写レベルを評価した。ヒトとネズミの3サブユニットは心配糖体に対して感受性があるが、ネズミの1アイソフォームはヒトのアイソフォームに比べて心配糖体処理に対する感受性が有意に低い(31, 32)。模擬感染およびCHIKV感染したU-2 OSおよびST2細胞からRNAを単離し、逆転写PCR（RT-PCR）の鋳型として用いて、ATP1A1（1）、ATP1A3（3）、およびGAPDH（グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ）（対照として）mRNAを増幅した（図3C）。ATP1A1の発現は、U-2 OS細胞とST2細胞の両方で検出され、感染後に有意な差は見られなかった。対照的に、ATP1A3転写産物はU-2 OS細胞で検出されたが、ST2細胞では検出されなかった。したがって、マウス細胞におけるATP1A3の発現低下は、ジゴキシンを介したCHIKV阻害に対する感受性の低下と相関している。
ナトリウム-カリウムAT-Paseの遮断がCHIKV阻害の原因であるかどうかを決定するために、U-2 OS細胞をCHIKV吸着前に1時間、ジゴキシンまたは関連心配糖体であるウアバインの濃度を上げて処理した。感染後6時間で、間接免疫蛍光法により感染の有無を調べた（図4A）。ここでも、ウアバインで細胞を処理すると、CHIKV感染は用量依存的に減少した、これは、2つの独立した心臓配糖体で細胞を処理すると、CHIKV感染が減少することを示している。ナトリウム-カリウムATPアーゼが唯一知られている心配糖体の標的であることから、これらのデータは、ジゴキシンがCHIKVを抑制するメカニズムがこの分子に拮抗していることを示唆している。ジゴキシン処理によるCHIKVの阻害が、イオン濃度の変化を介して起こるかどうかをさらに調べるために、CHIKV吸着前に、細胞外のナトリウムまたはカリウムを増加させた状態で、細胞をDMSOまたはジゴキシンで1時間前処理した。感染後6時間で、間接免疫蛍光法により感染の有無を調べた（図4B）。ジゴキシン存在下で細胞外NaClを添加すると、ジゴキシンによるCHIKVの阻害が用量依存的に増強された（図4B、左）。さらに、ジゴキシン存在下で細胞外KClを添加すると、ジゴキシンによるCHIKVの阻害が緩和された。を緩和した（図4B、右）。これらのデータは、イオン濃度の変化がジゴキシンの抗ウイルス活性に寄与していることを示している。

図4 ジゴキシンによる阻害はナトリウム-カリウムATPaseを介して起こる。(A）U-2 OS細胞を、5 PFU/細胞のMOIでCHIKV SL15649を吸着させる前に、DMSO、10 µM 5-NT、または高濃度のジゴキシンまたは関連する心臓配糖体であるウアバインとともに1時間インキュベートした。1時間後、ウイルスを除去し、細胞をDMSOまたは阻害剤を含む培地で5時間インキュベートした。結果は、3連実験のDMSO処理細胞に対して正規化した感染細胞のパーセンテージで示した。エラーバーは平均値の標準誤差を示す。(B）U-2 OS細胞を、5 PFU/細胞のMOIでCHIKV 181/25を吸着させる前に、標準培地または濃度の増加したNaCl（左）またはKCl（右）を添加した培地中で、DMSOまたはジゴキシンとともに1時間インキュベートした。1時間後、ウイルスを除去し、細胞をDMSOまたはジゴキシンを含む培地、および示した濃度のNaClまたはKClで5時間インキュベートした。結果は、3連実験のDMSO処理細胞に対して正規化した感染細胞のパーセンテージとして示した。エラーバーは平均値の標準誤差を示す。ANOVAとTukeyのpost hoc testの結果、*, P < 0.05, **, P < 0.01, ***, P < 0.001。

ジゴキシンによるCHIKV阻害は、細胞生存率の低下に起因するものではない。ナトリウム-カリウムATPアーゼは、ほとんどの多細胞生物において、ホメオスタシスに必須である。そのため、ジゴキシンによるCHIKV感染の阻害が、処理した細胞の生存率の変化の結果として起こるかどうかを明らかにしようとした。ジゴキシンの細胞毒性の可能性を評価するため、DMSO、スタウロスポリン（STS）（細胞死誘導剤として）、または高濃度のジゴキシンで処理した後、細胞をヨウ化ピジウム（PI）またはプレストブルーでインキュベートし、それぞれ細胞膜の完全性とミトコンドリア代謝活性を評価した（図5）。U-2 OS細胞をジゴキシンでインキュベートしても、処理後6時間までの細胞生存率に変化はなかった（図5AおよびB）。さらに、細胞生存率はこの用量は、これらの細胞におけるCHIKV抗ウイルス活性のジゴキシンEC50の20倍である（図5B）。ジゴキシンはまた、これらの細胞におけるCHIKV感染を阻害する用量のジゴキシンで処理した後、HSFsおよびVero細胞の生存率を有意に低下させなかった（データは示さず）。これらのデータから、ジゴキシンによるCHIKV阻害は細胞毒性作用に起因するものではないことが示唆される。

図5 ジゴキシンによるCHIKV阻害は細胞毒性に起因しない。(A) U-2 OS細胞をDMSO、10μM STS、または高濃度のジゴキシンで6時間処理し、細胞生存率をPI染色で定量した。結果は、個々の実験について、DMSO処理細胞に対して正規化した生存細胞のパーセンテージで表した。横の黒線は生存率の平均パーセンテージを示す。(B）U-2 OS細胞をDMSO、10μM STS、または高濃度のジゴキシンで6時間または24時間処理した。結果は、3連の実験について、DMSO処理細胞に対して正規化した生存細胞のパーセンテージで示した。エラーバーは平均値の標準誤差を示す。ANOVAとTukeyのpost hoc testにより、*, P < 0.05, ***, P < 0.001をDMSOと比較した。

ジゴキシン治療は多様なウイルスファミリーの感染を阻害する。ジゴキシンがCHIKVの他の株および関連するアルファウイルスによる感染を阻害するかどうかを調べるため、CHIKV SL15649株および181/25株、RRV T48株、SINV TRSB株による感染に対するジゴキシン処理の効果を評価した。U-2 OS細胞をDMSO、5-NT、またはジゴキシンで1時間処理した後、CHIKV、RRV、またはSINVをそれぞれ1、10、または5 PFU/細胞の感染多重度（MOI）で吸着させた。吸着後6時間で、細胞は間接免疫蛍光法によって感染の有無をスコア化された（図6A）。ジゴキシン処理は、試験したすべての菌株による感染を有意に減少させ、EC50はCHIKV SL15649株で108.9 nM、CHIKV 181/25株で100.9 nM、RRVで126.5 nM、SINVで198.9 nMであった。

図6 ジゴキシンは複数のアルファウイルス、哺乳類レオウイルス、およびVSVを阻害する。(A) U-2 OS細胞を、1 PFU/cellのMOIでCHIKV株SL15649および181/25、10 PFU/cellのMOIでRRV株T48、または5 PFU/cellのMOIでSINV株TRSBと吸着させる前に、DMSO、10 µM 5-NT、または濃度の増加したジゴキシンと1時間インキュベートした。1時間のインキュベーション後、ウイルスを除去し、細胞をDMSOまたは阻害剤を含む培地で5時間インキュベートした。細胞をウイルス特異的抗血清とDAPIで染色して核を検出し、蛍光顕微鏡で画像化した。結果は、3連実験のDMSO処理細胞に対して正規化した感染細胞のパーセンテージで示した。エラーバーは平均値の標準誤差を示す。(B）1,500粒子/細胞（～15 PFU/細胞）のMOIでレオウイルスビリオン（左）またはISVP（右）を吸着させる前に、HBMECをDMSO、10 µM 5-NT、または高濃度のジゴキシンと1時間インキュベートした。1時間のインキュベーション後、ウイルスを除去し、細胞をDMSOまたは阻害剤を含む培地で20時間インキュベートした。結果は、二重実験についてDMSO処理細胞に対して正規化した感染細胞のパーセンテージで示した。エラーバーは平均値の標準誤差を示す。挿入図は、レオウイルスビリオンとISVPの模式図である。(C) U-2 OS細胞を、10 PFU/細胞のMOIでVSV-eGFPを吸着させる前に、DMSO、20 mM NH4Cl、またはジゴキシンと1時間インキュベートした。1時間後、ウイルスを除去し、細胞をDMSOまたは阻害剤を含む培地で5時間インキュベートした。細胞をヘキスト染色でインキュベートして核を検出し、蛍光顕微鏡で画像化した。結果は、3連実験のDMSO処理細胞に対して正規化した感染細胞のパーセンテージで示した。エラーバーは平均値の標準誤差を示す。ANOVAとTukeyのpost hoc testの結果、*, P < 0.05, **, P < 0.01, ***, P < 0.001。

ジゴキシンが多様なウイルスファミリーに対して阻害作用を示すかどうかを調べるため、我々は、非エンベロープ型二本鎖RNAウイルスである哺乳類レオウイルスに対するジゴキシンの阻害能力を評価した。ヒト脳微小血管内皮細胞（HB- MEC）をDMSO、5-NT、またはジゴキシンで処理した後、レオウイルスビリオンまたは感染性サブビリオン粒子（ISVP）で吸着させた。ISVPは、エンドサイトーシスや細胞内カテプシンによるウイルス外カプシドの切断、あるいはプロテアーゼ処理後のin vitroで形成されるレオウイルス分解中間体である(34)。ISVPは細胞表面レセプターに結合し、酸性pHやプロテアーゼ活性を含むビリオンの分解要件をバイパスして、細胞膜で内在化する(34-37)。レオウイルスビリオンまたはISVPのいずれかを吸着後20時間で、間接免疫蛍光法により細胞の感染をスコア化した（図6B）。ジゴキシンでの処理は、ビリオン（図6B、左）とISVP（図6B、右）の両方による感染を阻害し、EC50はそれぞれ133.9 nMと434.7 nMであった。ジゴキシン処理後のISVPの感染性の減少は、ジゴキシンが、内在化と分解に続く1つ以上の複製ステップで、レオウイルスの感染を阻害することを示唆している。我々はまた、エンベロープを持つネガティブセンスRNAウイルスであるVSVを阻害するジゴキシンの能力も試験した（図6C）。ジゴキシン処理も同様にVSVによる感染を阻害し、そのEC50は238.7 nMであった。これらのデータは、ジゴキシンがプラス鎖、マイナス鎖、二本鎖RNAウイルスによる感染を阻害することを示している。

ジゴキシンは、CHIKV感染のポストエントリー段階を阻害する。次に、ジゴキシンによって阻害されるCHIKV複製のステップを明らかにしようとした。ジゴキシンがCHIKV感染を阻害する時間的ウィンドウを決定するために、U-2 OS細胞をDMSOまたは1Mジゴキシンで吸着前1時間、または吸着後4時間、15分または60分間隔で処理した。CHIKVの侵入阻害のコントロールとして、20 mM NH4Clを同じ間隔で添加し、エンドサイトーシス区画の酸性化を阻害した。吸着後6時間で細胞を固定し、間接免疫蛍光法で感染の有無をスコア化した（図7A）。ジゴキシンによるCHIKV感染の最大阻害は、ジゴキシンを吸着の60分前に添加した場合に達成された。阻害の大きさは、薬剤を添加する時間が遅くなると徐々に減少し、吸着から120分後に添加した場合には無視できる程度の効果しか観察されなかった。CHIKVはジゴキシン阻害を速度論的に回避した。これは、ジゴキシンが複製サイクルの初期段階でCHIKV感染を制限することを示唆している。アルファウイルスの非構造タンパク質と二本鎖RNA（dsRNA）は、感染細胞の細胞膜に蓄積して複製複合体を形成し、早ければ吸着後45分で、RNA合成は吸着後1時間までに検出される(28, 38)。従って、ジゴキシンはCHIKV複製におけるこれらの段階、あるいはそれ以前の段階を阻害する可能性がある。

図7 ジゴキシンは複製サイクルのポストエントリー段階においてCHIKVを阻害する。(A) U-2 OS細胞を、5 PFU/細胞のMOIでCHIKV 181/25を1時間吸着させる前（-60〜-15分）、吸着中（0〜+45分）、または吸着後（+60〜+240分）に、DMSO、20 mM NH4Cl、または1 µMジゴキシンとインキュベートした。結果は、3連実験のDMSO処理細胞に対して正規化した感染細胞のパーセンテージで示した。エラーバーは平均値の標準誤差を示す。(B) CHIKV株181/25（左）またはSINV株TRSB（右）を100PFU/細胞のMOIで4℃で1時間吸着させる前に、U-2 OS細胞をDMSO、10μM 5-NT、または示した濃度のジゴキシンとともに1時間インキュベートした。結合していないウイルスを除去し、細胞を37℃で5分間、細胞膜でのウイルス融合を誘発する酸性培地（pH 5.5［黒棒］）またはコントロールとして中性培地（pH 7.4［白棒］）で処理した。DMSOまたは阻害剤とNH4Clを含む培地で細胞を37℃で18時間インキュベートし、その後の感染をブロックした。細胞は間接免疫蛍光法で感染の有無を判定した。結果は3連実験の感染細胞のパーセンテージで示した。エラーバーは平均値の標準誤差を示す。ANOVAとTukeyのpost hoc testにより、DMSOと比較して、*はP < 0.05、***はP < 0.001であった。

ウイルスの侵入（付着、内在化、膜融合）を阻害することによってジゴキシンがCHIKV感染を阻害するかどうかを決定するために、CHIKVまたはSINVを4℃で吸着させる前に、細胞をDMSO、5-NT、またはジゴキシンで1時間処理し、相互成化を防止した。吸着後1時間で、細胞を酸性培地（pH 5.5）にさらし、細胞膜でのウイルス融合を誘発した。またはコントロールとして中性培地（pH7.4）に暴露した。融合した細胞および融合していない細胞を、その後の複製をブロックするために37℃で薬物およびNH4Clとともにインキュベートし、間接免疫蛍光法によって吸着後18時間で感染の有無をスコア化した（図7B）。細胞膜での融合を引き起こすと、ウイルスの侵入ステップを阻害する5-NT処理によるCHIKVおよびSINVの阻害が部分的に回避された（30）。しかし、細胞膜での融合は、使用した最低濃度を除き、ジゴキシンによるCHIKVまたはSINVの阻害をバイパスしなかった。CHIKVに結合したジゴキシン処理細胞の割合は、DMSO処理細胞の割合と同様であった（補足資料のFig.）ジゴキシン処理細胞をCHIKVでエレクトロポレーションした後のウイルス力価も同様に低下した。RNAでジゴキシン処理した細胞を電気穿孔した場合、DMSO処理した細胞を電気穿孔した場合と比較して、ウイルス力価は同様に低下した（補足資料のFig.）これらのデータを総合すると、CHIKVの複製は、ウイルス複製サイクルの1つ以上のポストエントリー段階において、ジゴキシンによって阻害されることが示唆される。

ジゴキシン耐性CHIKV集団で観察された多型。ジゴキシンを介したCHIKV感染制限のメカニズムの理解を深めるため、DMSOまたはジゴキシンで処理した細胞でCHIKVを継代培養し、ジゴキシン耐性ウイルスを選択した。U-2 OS細胞にCHIKV SL15649株を1時間吸着させ、DMSOまたは100 nMジゴキシンを含む培地で、同等の細胞病理効果（CPE）が観察されるまでインキュベートした。感染細胞の上清を新鮮細胞の接種に使用し、U-2 OS細胞でEC50の5倍の用量でCPEが観察されるまで、ジゴキシンの濃度を増加させながらこのプロセスを繰り返した。ジゴキシン処理細胞の上清に薬剤耐性ウイルスが含まれているかどうかを調べるために、DMSO処理（SL15649DMSO）およびジゴキシン処理（SL15649Digoxin）の継代14上清を吸着させる前に、U-2 OS細胞をDMSO、5-NT、またはジゴキシンで前処理した。細胞からの継代14上清を用いた。感染した細胞は、感染後6時間目に間接免疫蛍光法で感染の有無をスコア化した（図8A）。細胞を5-NTで処理すると、SL15649DMSOおよびSL15649Digoxin上清ストックの両方による感染が阻止された。対照的に、細胞を500 nMのジゴキシンで処理すると、SL15649DMSOによる感染は完全に阻害されたが（EC50は198.8 nM）、この用量ではSL15469Digoxinによる感染性は約50％しか阻害されなかった（EC50は521.4 nM）。これらのデータは、ジゴキシン処理細胞での連続継代中に選択されたウイルス変異体は、ジゴキシンの阻害効果に対して感受性が低いことを示唆している。

図8 ジゴキシン存在下でCHIKVを継代すると、薬剤耐性ウイルスが増加する。U-2 OS細胞を、DMSO（SL15649DMSO）またはジゴキシン（SL15649Digoxin）の存在下で5 PFU/細胞のMOIで14回継代したCHIKVストックと吸着させる前に、DMSO、10 µM 5-NT、または増加濃度のジゴキシンと1時間インキュベートした。1時間後、ウイルスを除去し、細胞をDMSOまたは阻害剤を含む培地で5時間インキュベートした。細胞をCHIKV特異的抗血清およびDAPIで染色して核を検出し、蛍光顕微鏡で画像化した。結果は、DMSO処理細胞に対して正規化した感染細胞のパーセンテージで示した。エラーバーは平均値の標準誤差を示す。(B) SL15649DMSOまたはSL15649Digoxinストックからプラーク精製したウイルスクローンを5 PFU/細胞のMOIで吸着させる前に、U-2 OS細胞をDMSOまたは500 nMジゴキシンと1時間インキュベートした。1時間後、ウイルスを除去し、細胞をDMSOまたはジゴキシンを含む培地で5時間インキュベートした。細胞をCHIKV特異的抗血清およびDAPIで染色して核を検出し、蛍光顕微鏡で画像化した。結果は、二重実験についてDMSO処理細胞に対して正規化した感染細胞のパーセンテージで示した。エラーバーは平均値の標準誤差を示す。ANOVAとTukeyのpost hoc testの結果、*, P < 0.05, **, P < 0.01, ***, P < 0.001。

ジゴキシン耐性の遺伝的基盤を決定するために、プラーク精製によってSL15649DMSOとSL15649ジゴキシンsu-pernatantストックからウイルスクローンをアイソレートし、ジゴキシン処理に対するこれらのウイルスクローンの感受性を評価した（図8B）。一般に、SL15649Digoxinストックから単離されたウイルスクローンは、SL15649DMSOストックから単離されたウイルスクローンよりもジゴキシン媒介阻害に対してより抵抗性であったが、1つのクローン（SL15649Digoxinクローン2）は、SL15649DMSOクローンと同様にジゴキシン処理に対して感受性であった。これらのウイルスクローンが示す多型を同定するために、各クローンの全長ヌクレオチド配列を決定した（表1）。配列分析により、DMSO処理細胞のウイルスクローンでは3つのユニークな非同義変異が同定され、ジゴキシン処理細胞のウイルスクローンでは6つのユニークな非同義変異が同定された。E2 S159R多型は、DMSO処理細胞とジゴキシン処理細胞の両方のウイルスクローンで同定され、細胞培養の適応とグリコサミノグリカン依存性の増加の結果として選択された可能性が高い(39)。しかしながら、ジゴキシン処理細胞のウイルスクローンで同定されたユニークな変異は、非構造オープンリーディングフレームに含まれていた。変異の大部分はnsP3にあったが、ジゴキシン感受性のSL15649Digoxinクローン2もこれらの変異をコードしていたため、これらの変異はジゴキシン耐性とは完全に分離しなかった。その代わりに、RNA依存性RNAポリメラーゼ（RdRp）の変異、nsP4 V209Iが、SL15649Digoxinクローン2（感受性）とクローン3および4（耐性）の間で異なる唯一のコード化変化であった。NIAID ViPRデータベースで利用可能な290のCHIKV株配列はすべて、nsP4の残基209にバリンをコードしており(40)、nsP4のこの残基または領域が、CHIKVの複製において重要かつ保存された機能を果たしていることが示唆された。これらの知見は、ジゴキシン処理細胞でCHIKVを継代する間に、複数の突然変異が選択されることを示している。さらに、非構造タンパク質、特にnsP4 V209Iにおける変異の選択は、ジゴキシンがRNA合成または複製複合体形成を阻害することによってCHIKVの複製を阻害することを示唆している。

表1 　DMSOまたはジゴキシンで処理した細胞におけるCHIKVの連続継代により同定された多型

a 感染したDMSOまたはジゴキシン処理細胞の上清中のウイルス力価をプラークアッセイで測定し、個々のプラークからのウイルスをU-2 OS細胞を用いて増幅した。
b 感染したU-2 OS細胞の上清から単離したRNAを、ランダムヘキサマーによるcDNA合成の鋳型として用いた。ゲノムを覆う重複断片をCHIKV特異的プライマーを用いて増幅し、サンガー配列決定で塩基配列を決定した。

考察

CHIKVは、アフリカ、南アジア、東南アジア、アメリカ大陸全域で、発熱、発疹、関節炎の流行を引き起こすために再興した。蚊を媒介とするCHIKVの急速な伝播により、過去10年間だけでも数百万人のCHIKV患者が発生している。CHIKV感染症の高い発症率と世界的な重要性から、CHIKVに特異的な治療薬やワクチンの開発が必要とされている。今のところ、そのような治療薬はない。

CHIKVの複製に必要な宿主因子の理解を深めるため、我々はU-2 OS細胞におけるCHIKV感染を減少または促進する能力を持つ化合物のライブラリーをスクリーニングした。その結果、CHIKVの複製を阻害する宿主種特異的な阻害剤として、心臓配糖体のジゴキシンを同定した。ジゴキシンは、複製サイクルのポストエントリー段階において、ナトリウム-カリウムAT-パーゼの拮抗を介してCHIKV感染を阻害することを発見した。ジゴキシン処理した細胞でCHIKVを継代すると、非構造タンパク質に複数の変異が選択され、そのうちの1つの変異、nsP4 V209Iはジゴキシン感受性と分離した。これらの結果から、CHIKV感染には機能的なナトリウム-カリウムATPアーゼが必要であることが示された。

我々の結果は、ジゴキシンによるCHIKVの阻害は、ウイルス複製サイクルの初期段階であるが、エントリー後の段階で起こることを示している。ジゴキシンによる阻害が起こる時間的ウィンドウは、塩化アンモニウムによる阻害とよく似ており、CHIKV感染に対する早期の阻止を裏付けている（図7A）。しかしながら、ジゴキシンが介在する欠損を迂回しようとして、CHIKVまたはSINVを細胞膜で融合させても、ウイルス複製を未処理細胞のレベルまで回復させるには不十分であった（図7B）。類似のケースでは、in vitroで ISVPを形成するためのレオウイルスビリオンのタンパク質分解切断は、侵入阻害剤である5-NTによる再阻害を克服したが、ジゴキシンによる阻害を完全に回避するには不十分であった。ISVPは細胞膜から細胞内に侵入すると考えられており、したがって、レオウイルスの内在化または分解を阻害する化合物による阻害を受けにくい(35, 36, 41)。ジゴキシン処理細胞でのウイルス継代後、CHIKVの非構造タンパク質に複数の変異が選択されたことも、ジゴキシンの作用機序として、ウイルス侵入後の複製ステップの阻害を示唆している。これらの変異の大部分は、CHIKV複製複合体の形成と宿主のストレス応答の調節に不可欠なタンパク質であるnsP3で選択されたが（42-46）、これらの変異はジゴキシン感受性変異体（SL15649Digoxin clone 2）でも観察された。それ以外の同種のウイルス（SL15649Digoxinクローン2～4）では、nsP4 V209I多型はジゴキシン処理に耐性を与えるのに十分であったが、ジゴキシン耐性の表現型は、nsP4のレベルを高めるnsP3 Stop524C変異の存在に依存している可能性があり、nsP4の1つ以上の機能がジゴキシンによって損なわれていることを示唆している。しかし、さらに変異を組み合わせると、ジゴキシン耐性ウイルス（SL15649Digoxinクローン1）を産生する可能性もある。我々は、非構造タンパク質をコードする遺伝子内の個々の、あるいは組み合わせによる置換が、ジゴキシン阻害を回避して複製効率を回復させることができ、nsP4における置換が極めて重要な役割を果たすと結論付けた。

ナトリウム-カリウムATPアーゼが阻害されると、イオン輸送が阻害され、多くの細胞の生合成、シグナル伝達、小胞の選別経路が変化する(47)。ジゴキシンがCHIKV感染を抑制する正確なメカニズムは不明であるが、2つの可能性が考えられる。第一に、CHIKVはウイルス複製サイクルの個別のステップを完了するために、あるいは特定のウイルスタンパク質の機能を調整するために、特定のイオン組成を必要とする可能性がある。イオンチャネル形成におけるアルファウイルス6Kタンパク質の機能と、アルファウイルス粒子の成熟が培養液のイオン強度に敏感であることから、イオンが必要であることが証明された(48, 49)。6Kによって形成されるイオンチャネルはNa,K,Ca2イオンに選択的であり、これらは心配糖体処理中に特異的に変化する(48)。この可能性を裏付けるように、ジゴキシン処理中に細胞外カリウムを添加すると、DMSO処理細胞で観察されたレベルまで感染性が回復することがわかった（図4B）。第二に、ジゴキシンはCHIKVの複製を阻害する細胞ストレス応答を誘導する可能性がある。心筋グリコサイド処理は、ナトリウム-カリウムATPアーゼとイノシトール1,4,5-三リン酸受容体（Ins[1,4,5]P3R）の相互作用を刺激してカルシウム振動を誘発し、核転写因子B（NF-B）などのカルシウム依存性転写因子を活性化する（50, 51）。NF-Bの活性化は、アポトーシスや自然免疫応答に関与する遺伝子産物の発現を促進し、CHIKV感染を多面的に制限する抗ウイルス状態を促進する(52)。ジゴキシンの投与はNF-Bの適度な活性化を誘導したが（補足資料の図S3を参照）、この増加は統計的に有意ではなかったことから、ジゴキシンによるCHIKVの制限には、他のカルシウム依存性宿主分子が寄与していることが示唆された。例えば、CHIKV複製複合体の形成や特定のウイルスタンパク質の機能には、特定のイオン濃度の正確な空間的・時間的調節が必要である可能性がある。ジゴキシンは、これらのウイルス活動を二次的に阻害し、複製を阻害するか、あるいは宿主のストレス応答を誘発し、その結果、同じ効果を達成する可能性がある。ジゴキシン耐性ウイルス変異体は、nsP4 V209Iを含む非構造タンパク質の残基を変化させ、これらのタンパク質のイオン制御機能を強化することによって、この障害を克服している可能性がある。

心筋グリコシドを介した細胞への作用が複雑であるため、CHIKV阻害のメカニズムが複数存在し、ジゴキシン耐性変異体の選択が困難になっているのかもしれない。実際、ジゴキシンで処理した細胞でCHIKVを継代すると、約14回、72時間継代した後にのみ薬剤耐性が発現した。ジゴキシンは現在、以下の治療薬としてFDAに承認されている。ジゴキシンは現在、うっ血性心不全と不整脈の治療薬としてFDAに承認されているが、ジゴキシンの臨床的に重大な毒性により、その普及が妨げられている(53-55)。ジゴキシンで治療を受けている患者の血清中許容濃度は1～2.5 nMであり、in vitroでCHIKVを阻害するのに必要な濃度よりかなり低い。したがって、毒性を抑制するために、この経路内の段階をより選択的に標的とする薬剤の開発には、さらなる研究が必要である。この点に関しては、ジゴキシンの毒性の低い誘導体が、自己免疫疾患の治療におけるTH17細胞の分化阻害に有効である(56)。ウアバインがCHIKV感染を阻害できることから、これらの類似化合物も同様の方法でCHIKV感染を減少させることが示唆される。

CHIKVに特異的な治療薬の同定には、CHIKVの複製と病態の理解を深めることが必要である。本報告で示された知見は、ナトリウム-カリウムATPアーゼがCHIKV感染に不可欠な機能を果たしていることを示唆している。このイオントランスポーターをジゴキシンで拮抗させると、ヒト細胞のCHIKV感染が阻害される。ジゴキシンは、CHIKV複製サイクルの1つ以上のポストエントリー段階を阻害することが、添加時間と融合バイパス実験によって証明された。ナトリウム-カリウムATPアーゼの阻害がCHIKV感染を阻害するメカニズムを明らかにするためのさらなる研究により、CHIKV複製に必要な宿主因子や経路が明らかになるだろう。このような因子は、CHIKV感染症を改善するための新たな創薬ターゲットとなる可能性がある。

材料と方法

細胞、化学阻害剤、抗体、プラスミド。U-2 OS細胞は、10％ウシ胎児血清（FBS [Gibco]）を添加したMcCoy's 5A培地（Gibco）で維持した。初代HSFはJames W. Thomas（Vanderbilt University）より提供され、前述(57)のように培養した。ST2細胞はJulie A. Sterling（Vanderbilt University）から提供され、10％FBSを添加したRPMI1640培地で維持した。C2C12細胞はDavid M. Bader (Vanderbilt University)から提供され、10%FBS添加Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)で維持した。ベビーハムスター腎臓（BHK-21）細胞、C6/36細胞、およびVero細胞は、以前に記載されたように培養した(58)。HBMECは、Kwang Sik Kim（Johns Hopkins Univer-sity）から提供され、RPMI1640培地で前述のように培養した(59)。L929細胞は、5％FBSを添加したJoklik's minimum essential mediumで維持した。細胞維持のためのすべての培地は、2mM L-グルタミン（ギブコ）、100U/mlペニシリン、100g/mlストレプトマイシン（ギブコ）、および25ng/mlアムホテリシンB（シグマ）を含むように補充した。

バフィロマイシンA1（Sigma）、ジゴキシン（Sigma）、5-NTシュウ酸塩（Tocris）、ウアバイン八水和物（Sigma）、およびSTS（Cell Signaling Technology）をDMSOに懸濁した。CHIKV（VR-1241AF）、RRV（VR-1246AF）およびSINV（VR- 1248AF）の感染性アッセイには、ATCCから入手したポリクローナル抗血清を使用した。レオウイルス特異的ポリクローナル抗血清（60）をレオウイルス感染性アッセイに使用した。

バイオセーフティ CHIKV SL15649レプリコン粒子および複製コンピテントCHIKVの生成および試験を含む実験は、バンダービルト大学環境・健康・安全学部（Department of Environment, Health, and Safety）およびバンダービルト大学機関安全委員会（Institutional Safety Committee）によって承認されたプロトコルを用いて、生物学的安全キャビネット内の認定生物学的安全レベル3（BSL3）施設で実施した。

CHIKVレプリコン粒子の作製。3プラスミドCHIKV SL15649レプリコンシステムは、以前に記載されたように使用した（61）。CHIKV非構造タンパク質およびeGFP、カプシドタンパク質、エンベロープ糖タンパク質（E3～E1）をコードするプラスミドを直鎖化し、mMessage mMachine SP6転写キット（Ambion）を用いてin vitroで転写した。BHK-21細胞を3つのプラスミドから生成したウイルスRNAでエレクトロポレーションし、37℃で24時間インキュベートした。レプリコン粒子を含む上清をエレクトロポレーション細胞から回収し、遠心分離によって清澄化し、80℃で保存した。レプリコン粒子は、Vero細胞の単層でレプリコンストックを連続継代することにより、増殖コンピテント組換えウイルスを検査した。2回目の継代から72時間後にCPEが検出されなかった場合のみ、BSL3実験室からストックを除去した。

NCCのハイスループットスクリーニング 384ウェルプレート（Corning）に播種したU-2 OS細胞を、Bravo自動液体処理プラットフォーム（Velocity 11/Agilent）を用いて、DMSO、100 nMバフィロマイシンA1、または1 M濃度のNCCからの化合物で処理し、37℃で1時間インキュベートした。CHIKV SL15649 eGFP発現レプリコン粒子を、5感染単位（IU）／細胞のMOIで処理細胞のウェルに接種し、37℃で20～24時間インキュベートした。培地をELx405マイクロプレートウォッシャー（Biotek）を用いて吸引し、細胞をMultidrop Combi試薬ディスペンサー（Thermo Scientific）を用いて核を染色するためにHoechst色素とともにインキュベートした。細胞および核は、ImageX- press Micro XLイメージング・システムを用いて可視化した。全細胞と感染細胞は、1ウェルあたり2視野でMetaXpressソフトウェアを用いて定量した。各ウェルについてプレートの中央値と絶対偏差の中央値（MAD）を算出し、以下の式でロバストZスコアを算出した： Z スコア[log2(% infection) log2(median)]/[log2(MAD) 1.486]。3つの独立した複製物のうち少なくとも2つでロバストZスコアが 2または2であった場合、候補は陽性とみなされた。

ウイルスストックの作製。CHIKV 181/25およびSL15649感染クローンプラスミドは、以前に記載されたように作製した(62)。RRV株T48（pRR64）およびSINV株AR339（pTRSB）の完全長cDNA配列を含むプラスミドを、以前に記載されたように作製した（63、64）。CHIKV、RRV、およびSINV感染クローンプラスミドを直鎖化し、mMessage mMachine SP6転写キットを用いてin vitroで転写した。BHK-21細胞をウイルスRNAでエレクトロポレーションし、37℃で24時間インキュベートした。子孫ウイルスを含む上清をエレクトロポレーション細胞から回収し、遠心分離によって清澄化し、80℃で保存した。ウイルス力価は、Vero細胞またはBHK-21細胞を用いたプラークアッセイで測定した。CHIKV SL15649ウイルスを用いたすべての実験は、BSL3条件下で行った。

レオウイルス株T1L M1 P208S（65）は、プラスミドベースの逆遺伝学（66）を用いて作製した。精製ビリオンは前述の方法で調製した(67)。レオウイルス粒子濃度は、260nmでの光学密度1Uと2.1 1012粒子との等価性から決定した(68)。ウイルス力価は、L929細胞を用いたプラークアッセイにより決定した(66)。ISVP は、ビリオン粒子を-キモトリプシン(Sigma)で処理することにより生成した。

VSV-eGFPは、Sean Whelan (Harvard University)から提供され、BHK-21細胞上で前述のように増殖させた(69)。ウイルス力価は、Vero 細胞を用いたプラークアッセイにより測定した。

CHIKV、RRVおよびSINV感染性アッセイ。96ウェルプレート（Costar）に播種したビヒクルまたは化合物処理したU-2 OS、HSF、ST2、C2C12、およびC6/36細胞に、37℃（U-2 OS、HSF、ST2、およびC2C12）または28℃（C6/36）で1時間、様々なMOIでウイルス二溶性緩衝液（VDB）（25mM HEPESおよび1％ FBSを含むRPMI 1640培地）で希釈したCHIKV、RRV、またはSINVを吸着させた。細胞を氷冷メタノールで固定し、PBSで洗浄し、5% FBSと0. 細胞を、FBSとTXを含むPBS中のCHIKV-、RRV-、またはSINV-特異的ポリクローナル抗血清（1:1,500）と4℃で一晩インキュベートした。細胞をPBSで3回洗浄し、Alexa Fluor 488標識抗マウスIgG（1:1,000）と共に、FBSとTXを含むPBS中、室温で2時間インキュベートした。細胞および核は、ImageXpress Micro XLイメージングシステムを用いて、1ウェルあたり4視野で可視化した。感染率は、ウイルス感染細胞数を視野あたりの細胞総数で割って求めた。ジゴキシン処理後のCHIKV感染性は、完全培地またはNaClもしくはKCl添加培地中で希釈したビヒクルまたはジゴキシンでU-2 OS細胞を37℃で1時間前処理することにより、増加濃度のナトリウムおよびカリウム存在下で測定した。細胞を固定し、間接免疫蛍光法で染色してCHIKV抗原と核を検出し、上記のように可視化した。

RT-PCRによる遺伝子転写物の発現。RNAは、PureLink RNA minikit（Ambion）を用いてU-2 OS細胞およびST2細胞から単離した。cDNA合成のプライムとしてランダムヘキサマーを用いてSuperScriptIII first strand kit（Invitrogen）を用いてcDNAを調製し、ナトリウム-カリウムATPアーゼのヒトまたはマウス1および3アイソフォームおよびコントロールとしてGAPDHに特異的なプライマーを用いてKODポリメラーゼによるPCR増幅に用いた（プライマー配列については、補足資料の表S1を参照のこと）。反応産物は1％アガロースゲル（Life Technologies社製）で電気泳動して分離した。

細胞生存率の評価。直径60 mmのディッシュに播種したU-2 OS細胞を、DMSO、アポトーシス誘導剤として10 M STS、または高濃度のジゴキシンとともに37℃で6時間インキュベートした。細胞を蛍光活性化セルソーター（FACS）バッファー（2％FBS含有PBS）で洗浄し、PI（Sigma）で染色した。細胞染色は、BD LSRIIフローサイトメーターとFlowJoソフトウェア（Tree Star）を用いて定量した。あるいは、96ウェルプレートに播種したU-2 OS細胞を、DMSO、STS、または濃度の増加したジゴキシンとともに37℃で6時間または24時間インキュベートした。PrestoBlue試薬（Molecular Probes）を化合物処理細胞の上清に添加し、細胞を37℃で30分間インキュベートした。Synergy H1 プレートリーダー（BioTek社製）を用いて、細胞生存率の指標となる蛍光を定量した。

レオウイルス感染性アッセイ 96ウェルプレート（Costar）に播種したビヒクルまたは化合物処理HBMECに、室温で1,500粒子/細胞のMOIでレオウイルスビリオンまたはISVPを1時間吸着させた。細胞を0.5％TX含有PBS中、レオウイルス特異的ポリクローナル抗血清（1：1,000）と37℃で30分間インキュベートした。細胞をPBSで3回洗浄し、Alexa Fluor 488標識抗ウサギIgG（1:1,000）を0.5%TX含有PBS中、37℃で30分間インキュベートした。細胞はまた、核を染色するためにDAPIとインキュベートした。細胞および核は、ImageXpress Micro XLイメージングシステムを用いて、1ウェルあたり4視野で可視化した。感染率は、ウイルス感染細胞数を視野あたりの細胞総数で割って求めた。

VSV感染性アッセイ。96ウェルプレート（Costar）に播種したビヒクルまたは化合物処理したU-2 OS細胞に、VSV-eGFPを10 PFU/cellのMOIで37℃、1時間吸着させた。細胞および核は、ImageXpress Micro XLイメージング・システムを用いて、1ウェルあたり4視野で可視化した。感染性のパーセンテージは、以下の式で除した。GFP陽性細胞数を視野あたりの細胞総数で割ることにより求めた。

融合バイパスアッセイ。96ウェルプレート（Costar社製）に播種したU-2 OS細胞を、DMSO、5-NT、または高濃度のジゴキシンと37℃で1時間インキュベートした。結合培地で希釈したCHIKVまたはSINVで細胞を4℃で1時間吸着させ、結合培地で2回洗浄して未結合のウイルスを除去し、細胞膜での融合を誘発するためにあらかじめ加温した融合培地（25mM HEPES、1% FBS、30mM コハク酸、pH 5.5を含むRPMI 1640培地）または対照としてあらかじめ加温した結合培地のいずれかと37℃で5分間インキュベートした。培地を除去し、細胞をビヒクルまたは阻害剤と20 mM NH4Clを含む完全培地とともに37℃でインキュベートし、吸着後18時間に間接免疫蛍光によって感染をスコア化した。

ジゴキシン耐性変異体の選択。U-2 OS細胞に、VDB中0.01 PFU/細胞のMOIでCHIKV SL15649を37℃で1時間吸着させた。細胞を37℃で48～72時間、またはDMSO処理細胞とジゴキシン処理細胞でCPEが同等になるまで培養した。細胞培養上清を回収し、0.5mlをU-2 OS細胞の新しいフラスコへの接種に用いた。残りの上清は80℃で保存した。このようにしてウイルスを連続継代し、U-2 OS細胞における薬剤のEC50の5倍の用量に達するまで、ジゴキシン濃度を徐々に増加させた。

ジゴキシン耐性および感受性変異体の配列解析。DMSO-またはジゴキシン処理細胞の細胞培養上清からのウイルスが、BHK-21細胞を用いてプラーク精製され、RNAがPureLink RNA minikitを用いて単離された。cDNA合成のプライムとしてランダムヘキサマーを用いたSuperscriptIIIファーストストランドキットを用いてcDNAが調製され、ウイルスゲノム全体を集合的に包含する断片の増幅を可能にするCHIKV特異的プライマーセットを用いたKODポリメラーゼを用いたPCR増幅に供された。アンプリコンの塩基配列はSanger sequencing（GenHunter, Nashville, TN）を用いて決定した。

統計解析。一元配置分散分析（ANOVA）とTukeyのポストホックテスト（GraphPad Prism）を用いて、少なくとも2回の実験の平均値を比較した。0.05のP 値は統計的に有意であると判断した。

補足資料

本論文の補足資料は、http://mbio.asm.org/ lookup/suppl/doi:10.1128/mBio.00693-16/-/DCSupplemental.

テキスト S1、DOCX ファイル、0.02 MB。図S1、TIFファイル、0.2 MB。図S2, TIFファイル, 0.3 MB. 図S3, TIFファイル, 0.3 MB. 表S1, DOCXファイル, 0.02 MB.

謝辞

Bernardo Mainou、Kristen Ogden、Clint Smithの各氏には、原稿の批判的レビューをしていただいた。Dermody研究室のメンバーには、これらの研究中に有益な議論をしていただいた。NIH Clinical Collectionは、National Institutes of Health Molecu- lar Libraries Roadmap Initiativeを通じて提供され、Vanderbilt High-Throughput Screening Facilityから配布された。ハイコンテンツ画像の取得は、Vanderbilt High-Throughput Screening FacilityにおいてVanderbilt Institute of Chemical Biologyと共同で行った。フローサイトメトリー実験はVanderbilt Cytometry Shared Resourceで行った。

本研究は、Public Health ServiceのT32 HL07751（A.W.A.）、R01 AI108735（T.E.M.）、R01 AI123348（T.S.D.）、U54 AI057157（T.S.D.）およびElizabeth B. Lamb Center for Pediatric Researchの助成を受けた。また、本研究は、Public Health ServiceのVanderbilt-Ingram Cancer CenterのP30 CA68485およびVanderbilt Diabetes Research and Training CenterのP60 DK20593の支援も受けている。

資金提供に関する情報

Thomas E. Morrisonの努力を含む本研究は、HHS｜NIH｜国立アレルギー・感染症研究所（NIAID）（R01 AI108735）から資金提供を受けた。Terence S. Dermodyの努力を含む本研究は、HHS｜NIH｜国立アレルギー・感染症研究所（NIAID）（R01 AI123348およびU54 AI057157）から資金提供を受けた。Alison Whitney Ashbrookを含む本研究は、HHS｜NIH｜国立心肺血液研究所（NHLBI）（T32 HL07751）の助成を受けた。

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