〜 おへその乱読1000本ノック #0021 〜 DNAメチル化に基づく多組織老化予測因子:エピジェネティッククロック

　第21回「おへその乱読1000本ノック」へようこそ。
　老化研究が成熟するにつれて、私たちは老化を「理解する」だけでなく「測る」段階へと踏み込むようになりました。老化がある種の生物学的プロセスであるなら、曖昧な印象ではなく客観的な指標として定量できるはずです。しかし同時に、根本的な問いが立ち上がります。老化を測る時計は、老化そのものを映しているのでしょうか。それとも単なる相関的なマーカーにすぎないのでしょうか。
　さらに、もしエピゲノムの年齢がゼロに戻る現象が存在するとすれば、それは本当に若返りを意味するのでしょうか。それとも細胞の状態が初期化されるだけで、別のリスクを伴うのでしょうか。そして時計が示す加速とは何を意味するのか。がんや病態に見られる年齢の前倒しは、老化の促進なのか、それとも異なる種類のエピゲノム崩壊なのか。
　今回取り上げるHorvath (2013) は、DNAメチル化パターンから年齢を推定するエピジェネティック時計を確立し、老化研究を測定可能な世界へと変えた原点となる論文です。時計が開いた扉の先に何が見えるのか。本当に老化は数値として捉えられるのか。その射程と限界を、ここから読み解いていきます。

研究の背景

　老化現象の多くは、エピジェネティックな変化によって説明できる可能性がある。本研究では、そのひとつであるDNAメチル化に注目し、CpG二塩基におけるシトシン5位のメチル化を解析対象とした。加齢に伴うDNA低メチル化はサケ、ラット、マウスなど複数の種で古くから観察されてきた。一方、近年では多くのCpG部位が加齢とともに高メチル化を示すことも明らかになっている。これまでの研究により、加齢に伴って高メチル化または低メチル化を受ける遺伝子領域が幅広く同定されてきた。
　加齢関連高メチル化は、CpGアイランドや発生関連遺伝子に関わる特定の領域で優先的に生じることが分かっている。具体的には、二価クロマチンドメインのプロモーター領域やPolycomb群タンパク質の標的領域である。エピゲノムの状態は組織ごとに大きく異なり、加齢に伴う変化も組織特異的であった。しかし最近の研究では、性別、組織型、疾患状態、解析手法によらない共通の年齢依存的CpGシグネチャの存在も報告されてきた。
　従来、唾液や血液など特定の組織に基づく年齢予測モデルは提案されてきたが、単一の予測因子で組織を問わず年齢を推定できるかは不明であった。そこで本研究では、公開されているDNAメチル化データセットを大規模に統合し、組織横断的に適用可能な年齢予測因子を構築・評価した。得られた年齢推定値（DNAm age）は、老化研究および関連分野における多様な研究課題のバイオマーカーとして活用できる可能性が示された。

1. 多組織エピジェネティック時計の構築

　本研究では、DNAメチル化データに基づいて年齢を推定する予測因子を構築することを目的とした。加齢に伴うDNAメチル化の変化は多くの研究で報告されており、特定の組織（例：血液、唾液）における年齢予測モデルも提案されてきた。しかし、単一の予測因子によって組織型を問わず年齢を推定できるかどうかは明らかではなかった。
　そこで、公的に利用可能な82のDNAメチル化データセット（合計約8,000サンプル、51種類の組織・細胞型）を統合し、組織横断的に適用可能な年齢予測モデルの定義と評価を行った。解析では、ペナルティ付き回帰モデル（elastic net）を用いて、21,369個のCpG部位から年齢予測に最も重要な353個のCpG部位を自動的に選択した。これらのCpG部位のメチル化レベルの加重平均を較正関数で変換することで、推定年齢（DNAm age）が算出された。
　DNAm ageは多くの組織および細胞型に適用可能であり、多組織年齢予測因子（multi-tissue age predictor）として位置づけられた。

1.2 予測精度

　DNAm ageは実年齢と高い相関を示した。訓練データ全体での相関係数はr=0.97、誤差中央値は2.9年であり（Fig. 1A）、この高精度は個別の組織（全血、脳、肝臓、肺など）でも維持されていた（Fig. 1B–Y）。さらに独立したテストデータにおいてもr=0.96、誤差3.6年という高精度が確認され（Fig. 2A）、モデルの汎化性能が支持された。
　本研究ではこのモデルを多組織年齢予測因子（multi-tissue age predictor）と呼び、老化研究におけるバイオマーカーとして利用できる可能性が示された。

1.3 CpGの特性と応用展開

　　年齢予測因子を構成する353個のCpG部位（clock CpG）は、加齢に伴うDNAメチル化変化の特徴的なパターンを反映していた。これらのうち、193個は年齢とともにメチル化レベルが上昇（高メチル化）し、160個は低下（低メチル化）した（Fig. 6A）。
　clock CpGのゲノム分布を解析した結果、加齢に伴う高メチル化は、CpGアイランド、発生関連遺伝子に結びつく二価クロマチンドメインのプロモーター領域、およびPolycomb群タンパク質の標的領域に集中していた。一方、低メチル化はCpGアイランドショアや強エンハンサー領域に多く認められた（Additional file 9）。
　さらに、clock CpGが位置する遺伝子は、細胞死・生存、細胞増殖、組織発生、がんに関連する経路に濃縮しており（Additional file 7）、年齢依存的なDNAメチル化変化が発生プログラムや細胞運命決定に関与する遺伝子制御領域で生じることが示された。
　また本研究では、DNAm ageを基盤として、早老症、iPS細胞の誘導、がん組織などさまざまな文脈におけるDNAメチル化年齢の特徴が検討された。

2. 年齢予測精度と適用範囲

　本研究では、多組織年齢予測因子が幅広い組織・細胞型に適用可能であるかを検証した。テストデータにおいてDNAm ageは実年齢と高い一致を示し、相関係数はr=0.96、誤差中央値は3.6年であった（Fig. 2）。この結果から、多組織予測因子が独立データに対しても高い精度を維持することが確認された。

2.1 広範な適用範囲

　DNAm ageの予測精度は、全血や末梢血単核球などの不均一な組織だけでなく、CD4+ T細胞やCD14+単球といった単離された細胞型においても一貫して高かった（Fig. 2C）。また、小児や思春期のサンプルにおいても高い精度が得られ、血液、脳組織、口腔上皮など複数の組織で同様の傾向が確認された（Fig. 1B, F; Fig. 2B, I）。
　血液の異なる細胞型（寿命が数週間の単球と数年のT細胞）間でDNAm ageに有意差は認められず、DNAm ageは細胞型組成の変化ではなくDNAメチル化パターンそのものの年齢依存的変化を反映していることが示された。これらの結果から、年齢依存的CpGシグネチャは性別、疾患状態、解析プラットフォームの違いに依存せず、広範な組織に適用可能であることが確認された。
　さらに、データセット間の予測精度の差は年齢の標準偏差と有意に相関した一方で（r=0.49, P=4E-5; Fig. 3A）、サンプルサイズとは関連しなかった（Fig. 3B）。したがって、予測精度はサンプル数よりも年齢分布の幅に影響されることが示された。

2.2 精度が低い組織とその生物学的背景

　一方で、一部の組織ではDNAm ageの較正が不十分であり、高い誤差が観察された。具体的には、乳房組織（誤差13年）、子宮内膜（誤差11年）、骨格筋（誤差18年）、心臓組織（誤差12年）、皮膚線維芽細胞（誤差12年）で予測誤差が大きかった（Fig. 2H, L, P, S）。
　この精度低下に関わる生物学的要因として、乳房組織におけるホルモン環境やがん隣接組織でのフィールド効果、子宮内膜における月経周期に伴う細胞増殖、骨格筋や心臓における幹細胞を介した組織修復の影響が考察された。
　また精子では、ドナー年齢よりも著しく低いDNAm ageが観察され、組織特異的な例外として位置づけられた（Fig. 3I, J）。
　これらの結果から、多組織予測因子は広範な組織に適用可能である一方で、特定の組織では固有の生物学的プロセスによってDNAm ageが実年齢から乖離する場合が確認された。

3. 組織特異性と老化速度の差

　本研究では、DNAm ageが多くの組織で年齢推定に有効である一方で、組織によって推定値に系統的な差が生じることも示された。エピゲノムの状態は組織ごとに大きく異なり、脳と血液では異なるメチル化パターンを示す。そのため、加齢に伴うDNAメチル化変化にも組織特異的な側面が存在することが確認された。

3.1 非線形な老化速度

　353個のCpG部位の加重平均値を実年齢に対してプロットした結果、DNAm ageの時を刻む速度（tick rate）は一定ではないことが明らかになった（Fig. 6B, C）。出生から成人期に達するまでは対数的に急速に進行し、成人期以降は直線的な一定速度に移行した。この非線形性は、発生期における急速な細胞分裂や分化などの生物学的過程と対応する可能性が考察された。

3.2 組織間の差異

　組織間で平均DNAm ageを比較したところ、乳房組織は実年齢よりも高い値を示す傾向が認められた（Fig. 3C）。同一個体から採取した複数組織の解析では、脳の各領域（側頭皮質、橋、前頭皮質、小脳）間でDNAm ageに有意差は観察されなかった。一方、乳房組織は他の組織よりも著しく高い値を示した（Fig. 3E–G）。これらの結果から、DNAm ageは組織横断的な年齢指標であると同時に、組織ごとの老化の差異を反映する場合があることが示された。

3.3 種間比較

　本研究ではさらに、ヒト用のエピジェネティック時計をチンパンジー（Pan troglodytes）やボノボ（Pan paniscus）に適用し、血液サンプルで高い年齢相関（r=0.9、誤差1.4年）が得られたことが示された（Fig. 4C）。心臓、肝臓、腎臓においても同様の結果が確認された。一方で、進化的により遠いゴリラでは精度が低下した。これらの結果から、年齢依存的CpGシグネチャは霊長類間で保存されている可能性が示された。

4. 疾患への適用:早老症は正常老化と異なる

　本研究では、DNAm ageを疾患組織に適用することで、加齢関連疾患や早老症におけるDNAメチル化年齢の特徴を検討した。特に、臨床的に早期老化の特徴を示す疾患（premature aging diseases）が、DNAメチル化レベルにおいて正常老化の加速を示すかどうかを検証した。

4.1 早老症における年齢加速の欠如

　解析の結果、Hutchinson–Gilford progeria症候群（HGP）やWerner症候群（WPS）の患者から樹立したEpstein–Barr virus（EBV）トランスフォームB細胞では、健常対照群と比べてDNAm ageの加速は観察されなかった（Fig. 2T）。すなわち、臨床的に早期老化の特徴を示す疾患であっても、少なくともB細胞においてはDNAメチル化年齢は実年齢相応であり、正常老化が単純に加速した状態とは異なることが示された。

4.2 生物学的解釈

　これらの結果から、早老症は臨床的に老化様の表現型を示したが、DNAm ageの観点からは正常老化の加速としては捉えられないことが確認された。HGPでは核ラミンA異常によるゲノム不安定性、WPSではDNA修復機構の欠損が主要な病因として知られており、これらの疾患機構は正常老化とは異なる経路に基づくことが示された。
　したがって、DNAm ageは老化様疾患を正常老化と区別して理解するための指標となり得ることが示された。ただし、本研究で得られた知見はEBVトランスフォームB細胞に限定されており、早老症の他の組織（例：皮膚線維芽細胞や血管内皮細胞）における検証は今後の課題として残された。

5. リセットと逸脱：iPS細胞とがん

　本研究では、DNAm ageをiPS細胞とがん組織に適用し、エピジェネティック時計が極端な状態を示す2つの生物学的文脈を検討した。

5.1 iPS細胞誘導に伴うエピジェネティック時計のリセット

　本研究では、iPS細胞誘導による細胞初期化がDNAメチル化年齢に与える影響を解析した。その結果、成人の体細胞から作製されたiPS細胞は、元の体細胞と比較してDNAm ageが著しく低下し、胚性幹細胞（ES細胞）と同等のほぼゼロの値を示した（Fig. 5A–C）。この所見は3つの独立したデータセット（data sets 77, 78, 79）において再現された。
　さらに、iPS細胞とES細胞の間でDNAm ageに有意差は検出されず、リプログラミングによってエピジェネティック時計がリセットされることが確認された。
　一方で、iPS細胞やES細胞を培養下で継代すると、DNAm ageは継代数に応じて上昇した（Fig. 5F–J）。この相関はiPS細胞（r=0.33, P=0.025）およびES細胞（r=0.28, P=0.0023）の両方で認められ、DNAm ageが細胞分裂履歴と関連することが示された。

5.2 がん組織およびがん細胞株におけるDNAm ageの挙動

　本研究では、がん組織ならびにがん細胞株にDNAm ageを適用し、DNAメチル化年齢が正常組織とどのように異なるかを解析した。調査した20種類すべてのがん組織において、DNAm ageの有意な加速が観察された（Additional file 13B）。年齢加速の平均値は36.2年であり、がん組織では正常組織と比較して著しく高いDNAメチル化年齢を示すことが明らかになった。
　さらに、7種類のがん（急性骨髄性白血病、乳がん、腎がんなど）において、DNAm age加速が高いサンプルほど体細胞変異数の総数が少ないという有意な逆相関が観察された（Fig. 7）。また、がん抑制遺伝子TP53に変異を持つがんでは、変異のないがんと比べてDNAm age加速が有意に低いことが5種類のがんで確認された（Additional file 17）。

　がんタイプ別の解析では、乳がんにおけるエストロゲン受容体（ER）／プロゲステロン受容体（PR）変異、大腸がんにおけるBRAF変異、膠芽腫におけるH3F3A変異などがDNAm age加速と関連していた（Fig. 8, 9）。
　がん細胞株の解析では、59種類の細胞株全体でDNAm ageと患者実年齢との相関は有意ではなかった（Additional file 18B）。これは長期培養や不死化に伴うDNAメチル化パターンの再編成による可能性が考察された。ただし、細胞株間で年齢加速は大きくばらつき（最高182年から最低8年）、がん研究における指標としての応用余地が示された。

6. 結論

　本研究では、健康組織、がん組織、がん細胞株に由来する大規模なDNAメチル化データを解析し、多組織に適用可能な年齢予測因子を構築した。本手法では、353個のclock CpG部位の加重平均を算出し、較正関数によってDNAm ageへ変換することでDNAメチル化年齢が推定された。較正関数からは、エピジェネティック時計の刻みが成人期まで高く、その後一定の速度へ移行することが示された。
　本研究では、DNAm ageがエピジェネティック維持システム（epigenetic maintenance system, EMS）による累積的作業量を反映するというモデルが提案された。また、がん組織では顕著な年齢加速が観察され、DNAm ageをがん研究へ応用できる可能性が示された。
　DNAm ageは多様な組織・細胞型に適用可能であり、疾患による加速老化の検出や若返り介入の評価指標となる可能性が確認された。今後の研究では、DNAm ageが老化のマーカーにとどまるのか、老化の実行因子と関係するのかを明らかにする必要がある。本研究で示したエピジェネティック時計は、テロメア時計に加わる有用な指標となり得ることが示された。