〜 おへその乱読1000本ノック #0109 ～CASTOR1：アルギニンをmTORC1へつなぐ栄養センサー

　ようこそ、第109回 おへその乱読1000本ノックへ。
　前回は、Sestrin2がロイシンを選択的に認識する構造的な仕組みを見てきました。今回は、mTORC1上流に存在するアミノ酸センサーの中から、アルギニンを感知する仕組みに焦点を当てます。
　取り上げるのは、Chantranupong et al.（2016）による、CASTORタンパク質を介したアルギニン感知機構に関する論文です。アルギニンはmTORC1を活性化する主要なアミノ酸として知られていた一方で、細胞質中のアルギニンをどの分子が直接感知しているのかは、これまで明らかになっていませんでした。
　本論文では、CASTOR1がアルギニンに直接結合し、GATOR2との相互作用を介してmTORC1経路を制御していることが示されています。CASTOR1とCASTOR2の関係にも注目しながら、アルギニンという栄養シグナルがどのようにmTORC1上流へと伝えられるのか、その仕組みを読み解いていきます。

1．イントロダクション：mTORC1上流のアルギニン感知

1.1　アミノ酸によるmTORC1制御

　mTORC1は、アミノ酸、成長因子、エネルギー状態などの情報を統合し、タンパク質合成や細胞成長を促進するシグナル伝達複合体である。アミノ酸が十分に存在する条件下では、Rag GTPaseがmTORC1をリソソーム膜へ動員し、Rhebにより活性化される。
　Rag GTPaseの活性状態は複数の上流因子によって制御される。GATOR1はRagA/Bに対するGTPase活性化タンパク質として働き、mTORC1を抑制する。一方、GATOR2はGATOR1のさらに上流でmTORC1を促進するが、その分子機構は十分に明らかにされていなかった。ロイシン欠乏時にSestrinタンパク質がGATOR2へ結合することから、GATOR2は複数のアミノ酸シグナルが収束する制御点と考えられていた。
　mTORC1上流では、ロイシン、アルギニン、メチオニンなどの情報が、それぞれ異なるセンサーを介してGATOR複合体やRag GTPaseへ伝達される（参考図1）。

1.2　細胞質アルギニンセンサーという未解決課題

　アルギニンは、ロイシンと並んでmTORC1を強く活性化するアミノ酸である。リソソーム膜上のSLC38A9は、アルギニン情報をRag経路へ伝達する分子として同定されていた。しかし、SLC38A9欠損細胞においても、アルギニン欠乏によるmTORC1抑制は完全には失われず、SLC38A9とは独立したアルギニン感知機構の存在が示唆されていた。
　そこで本研究では、GATOR2と相互作用する未解析タンパク質に着目し、細胞質アルギニンを直接感知してmTORC1へ伝達する分子の同定を試みた。その結果、CASTOR1およびCASTOR2をGATOR2結合タンパク質として見いだし、このうちCASTOR1をアルギニン応答の主要な候補として解析した。

2．CASTOR1とCASTOR2の同定と複合体形成

2.1　GATOR2結合タンパク質としてのCASTOR1とCASTOR2

　GATOR2はmTORC1を正に制御する複合体であり、Sestrinタンパク質を介してロイシン情報を受け取ることが知られていた。そこで、GATOR2に結合する別のアミノ酸センサーが存在すると考え、ヒトタンパク質間相互作用データベースBioPlexを探索した。その結果、GATOR2の構成因子であるWDR24、WDR59、miosと相互作用する未解析タンパク質GATSL3を見いだし、cellular arginine sensor for mTORC1 1としてCASTOR1と命名した。また、CASTOR1に類似するGATSL2をCASTOR2とした（Fig. 1A）。
　CASTOR1とCASTOR2は63％のアミノ酸配列同一性をもち、いずれも二つのACTドメインを有していた（Fig. 1B、C）。ACTドメインは、アミノ酸などの低分子を結合し、タンパク質機能をアロステリックに制御する構造として知られている。この特徴から、CASTORタンパク質がアミノ酸感知に関与する可能性が考えられた。
　HEK293T細胞でHAタグ付きCASTOR1またはCASTOR2を発現させ、免疫沈降によって相互作用タンパク質を解析したところ、両者は内在性GATOR2構成因子miosと共沈した（Fig. 1D）。したがって、CASTOR1とCASTOR2はいずれもGATOR2結合タンパク質であることが確認された。

2.2　CASTOR1とCASTOR2はホモ二量体とヘテロ二量体を形成する

　ACTドメインをもつタンパク質は、しばしば会合して複合体を形成する。そこでCASTOR1とCASTOR2の相互作用を共免疫沈降により解析した。その結果、CASTOR1とCASTOR2はそれぞれ自己会合するとともに、互いにも結合した（Fig. 2A）。さらに、組換えCASTOR1は内在性CASTOR2と、組換えCASTOR2は内在性CASTOR1と共沈し、細胞内でも両者が複合体を形成することが示された（Fig. 2B、C）。
　精製したCASTOR1–CASTOR2複合体をSDS-PAGEで解析すると、両タンパク質はほぼ等量で含まれていた（Fig. 2D）。以上より、CASTORタンパク質は、CASTOR1ホモ二量体、CASTOR2ホモ二量体、およびCASTOR1–CASTOR2ヘテロ二量体という三つの複合体を形成すると考えられた。

3．アルギニンはCASTOR1へ直接結合してGATOR2との相互作用を解除する

3.1　アルギニン依存的なCASTOR1–GATOR2複合体の解離

　CASTOR1およびCASTOR2が形成する三種の複合体について、GATOR2との相互作用がアミノ酸状態によって変化するかを検証した。HEK293T細胞をアミノ酸欠乏条件に置くと、CASTOR1ホモ二量体およびCASTOR1–CASTOR2ヘテロ二量体とGATOR2との結合が増加し、アミノ酸を再添加すると速やかに低下した。一方、CASTOR2ホモ二量体はGATOR2と強く結合したままであり、アミノ酸状態による影響をほとんど受けなかった（Fig. 3A、B）。
　次に、ロイシンまたはアルギニンを個別に除去して比較したところ、いずれの条件でもmTORC1活性は低下したが、CASTOR1とGATOR2の結合を増加させたのはアルギニン欠乏のみであった。アルギニンを再添加すると、この結合は解除された（Fig. 3C）。
　さらに、アミノ酸欠乏細胞から免疫精製したCASTOR1–GATOR2複合体へ各アミノ酸を直接添加したところ、アルギニンだけが両者を解離させた。この作用は濃度依存的であり、20～40 µM付近で解離が半最大に達した（Fig. 3D、E）。したがって、アルギニンは細胞内の別のシグナルを介さず、CASTOR1を含む複合体に直接作用してGATOR2との結合を制御すると考えられた。
　CASTOR1を二つのACTドメイン領域に分割すると、両領域はアルギニン存在下で相互作用し、アルギニンを除くと解離した。一方、CASTOR2のACTドメイン間相互作用はアルギニンの有無にかかわらず維持された（Fig. 3F）。この対比は、CASTOR1のみがアルギニン応答性を示すという結果と一致した。

3.2　CASTOR1はアルギニンへ直接結合する

　CASTOR1がアルギニンを直接認識するかを調べるため、免疫精製したCASTOR複合体を用いて放射標識アルギニンの結合を解析した。その結果、アルギニンはCASTOR1ホモ二量体およびCASTOR1–CASTOR2ヘテロ二量体へ結合したが、CASTOR2ホモ二量体には結合しなかった（Fig. 4A、B）。ロイシンやリジンはCASTOR1へ結合せず、CASTOR1がアルギニンを選択的に認識することが示された。
　哺乳類細胞由来の試料に混入する別のタンパク質がアルギニンを結合している可能性を排除するため、大腸菌で発現・精製したCASTOR複合体でも同様の解析を行った。この場合もCASTOR1ホモ二量体とCASTOR1–CASTOR2ヘテロ二量体はアルギニンを結合し、CASTOR1自体が直接結合することが確認された（Fig. 4C）。
　アルギニンに対する解離定数は、CASTOR1ホモ二量体で34.8 ± 5.9 µM、CASTOR1–CASTOR2ヘテロ二量体で24.2 ± 4.1 µMであった（Fig. 4D、E）。これらの値は、CASTOR1–GATOR2複合体の解離や細胞内でのmTORC1活性化に必要なアルギニン濃度とよく一致した（Fig. 4F）。以上より、CASTOR1はアルギニンを直接結合し、その結合に応じてGATOR2との相互作用を切り替えるセンサーとして機能することが示された。

4．CASTOR1はmTORC1のアルギニン応答に必要である

4.1　CASTOR1欠損によりアルギニン欠乏応答が弱まる

　CASTOR1がmTORC1のアルギニン応答に必要かを検証するため、まずHEK293T細胞でCASTOR1またはCASTOR2を過剰発現させた。いずれもアミノ酸刺激によるmTORC1活性化を抑制したが、CASTOR2はアルギニンを結合しないため、より持続的な抑制作用を示した（Fig. 5A）。
　次に、shRNAまたはCRISPR/Cas9によりCASTOR1を減少させると、アルギニン欠乏条件下でもS6K1 Thr389リン酸化が十分に低下せず、mTORC1はアルギニン不足に応答しにくくなった（Fig. 5B、C）。一方、ロイシン欠乏や全アミノ酸欠乏への応答は維持されており、この変化はアルギニン感知に選択的なものであった。
　さらに、CASTOR1をノックダウンした細胞へRNAi耐性CASTOR1を再導入すると、アルギニン応答は回復した。以上より、CASTOR1はアルギニン欠乏をmTORC1へ伝える負の制御因子として機能することが示された。

4.2　CASTOR1とSLC38A9は並列にアルギニン情報を伝える

　CASTOR1とは対照的に、CASTOR2を減少させると、アルギニン存在下でmTORC1活性がわずかに上昇した（Fig. 5D）。CASTOR2はアルギニンを結合せず、GATOR2との結合もほぼ一定であることから、アルギニン状態によらない恒常的な抑制因子として働くと考えられた。
　さらに、リソソーム膜上のアルギニン感知因子SLC38A9との関係を解析した。SLC38A9欠損細胞ではアルギニン刺激によるmTORC1活性化が低下したが、CASTOR1も同時に減少させると、mTORC1はアルギニンの有無にほとんど応答しなくなった（Fig. 5E）。この結果から、CASTOR1は細胞質側、SLC38A9はリソソーム側から、並列にアルギニン情報をmTORC1へ伝えると考えられた。

4.3　アルギニン結合能はCASTOR1のセンサー機能に必須である

　CASTOR1がアルギニンセンサーとして働くには、アルギニン結合能そのものが必要かを検証した。ACTドメインに対するアラニンスキャンにより、アルギニン結合を失うI280A変異体を同定した（Fig. 6A）。
　このI280A変異体はアルギニン存在下でもGATOR2から解離せず、恒常的に結合を維持した（Fig. 6B）。さらに、CASTOR1をノックダウンした細胞へ野生型CASTOR1を再導入するとアルギニン応答は回復したが、I280A変異体では回復せず、mTORC1はアルギニン存在下でも抑制されたままであった（Fig. 6C）。
　以上より、アルギニンがCASTOR1へ直接結合することは、CASTOR1–GATOR2複合体を解離させ、mTORC1のアルギニン応答を成立させるために必須であることが示された。

5．結論：CASTOR1は細胞質アルギニンセンサーである

　本研究では、CASTOR1が細胞質アルギニンを直接感知し、その情報をGATOR2を介してmTORC1へ伝える分子であることを明らかにした。アルギニン欠乏時にはCASTOR1がGATOR2へ結合し、Rag経路を介したmTORC1活性化を抑制する。一方、アルギニンがCASTOR1へ結合すると、CASTOR1–GATOR2複合体は解離し、mTORC1の活性化が可能となる。
　CASTOR1を減少させるとアルギニン欠乏応答は弱まり、アルギニン結合能を失うI280A変異体ではGATOR2との結合が維持されたままとなり、mTORC1のアルギニン応答も失われた。したがって、CASTOR1へのアルギニン結合は、GATOR2との相互作用を切り替え、アルギニン充足状態をmTORC1経路へ伝えるために必須である。
　さらに、CASTOR1は細胞質側からアルギニン欠乏を伝え、SLC38A9はリソソーム側からアルギニン存在を伝えると考えられた。この二つの感知系は並列に働き、アルギニン状態をmTORC1へ統合する。CASTOR1の同定により、GATOR2はロイシンを感知するSestrin系とアルギニンを感知するCASTOR系が合流する栄養感知の中心点として位置づけられた。